Yksi tärkeimmistä PCR-reaktioon valittavista komponenteista on DNA-polymeraasi. Ennen PCR-reaktion suunnittelua on pohdittava tutkittavan DNA-näytteen ominaisuuksia ja halutun lopputuotteen vaatimuksia. Onko DNA-näyte puhdas? Kuinka pitkä pätkä DNA:ta halutaan monistaa? Onko monistettavan DNA:n sekvenssissä paljon vahvoja G/C-nukleotidisidoksia tai sekundäärirakenteita? Mitä monistetulle DNA:lle on tarkoitus tehdä PCR-reaktion jälkeen? Kun edellä mainittuihin kysymyksiin on löytynyt vastaus, on syytä perehtyä markkinoilla olevien DNA-polymeraasien tarkkuuteen, spesifisyyteen, lämpöstabiiliuteen sekä prosessiivisuuteen. Millä näistä DNA-polymeraasien ominaisuuksista on juuri sinun tutkimuksessasi merkitystä?
Oikolukeva DNA-polymeraasi on oikea valinta, kun halutaan olla tarkkoja
DNA-polymeraaseista ensimmäisin ja vieläkin tunnetuin lienee kuumissa lähteissä elävästä Thermus aquaticus -bakteerista peräisin oleva Taq DNA-polymeraasi, jokatoimii edelleen mm. monissa genotyyppaus-, T/A-kloonaus-, multiplex-PCR-, colony PCR- ja real-time PCR-sovelluksissa. Useimmiten siis silloin, kun tarkastellaan PCR-tuotetta (semi)kvantitatiivisesti joko geelielektroforeesilla tai qPCR -laitteella. Taq DNA-polymeraaseja valmistetaan ja kehitetään edelleen uusin ominaisuuksin, koska laboratorioissa tehdään paljon rutiininomaisia PCR-töitä, joissa tarkkuus ei nouse päärooliin ja halutaan minimoida samalla kustannuspuoli. Tästä hyviä ja tunnettuja esimerkkejä ovat Promegan GoTaq® –, New England Biolabsin OneTaq®-, Thermo Scientificin DreamTaq™ – ja Biolinen MyTaq™ DNA-polymeraasiperheet, joiden Taq DNA-polymeraasit on optimoitu toimimaan hyvin vaihtelevissa reaktio-olosuhteissa.
Mikäli tarkoituksena on kuitenkin kloonata, sekvensoida tai mutatoida syntyvä PCR-tuote, on valittava DNA-polymeraasi, joka pystyy monistamaan haluttua DNA-sekvenssiä virheettömästi. Oikolukevilla DNA-polymeraaseilla on kyky korjata PCR-reaktiossa virheellisesti lisätyt nukleotidit oikeiksi (3’ -> 5’ exonuclease activity). Koska Taq DNA-polymeraasi on kovin epätarkka DNA-polymeraasi, myöhemmin kehitettyjen DNA-polymeraasien tarkkuutta usein verrataan suhteessa juuri siihen. Thermo Scientificin Platinum™ SuperFI™ II sekä New England Biolabsin Q5® High-Fidelity DNA-polymeraasit lienevät markkinoiden tarkimpia PCR-entsyymejä (tarkkuus >280 x Taq). Vuosikausia markkinajohtajana toiminut Phusion High-Fidelity DNA-polymeraasi puolestaan on edelleen kelpo entsyymi, jonka U-versio (tarkkuus on 25 x Taq) soveltuu mm. epigenetiikka-tutkimukseen.
Hot start on avain spesifiseen lopputulokseen
Hyvin harvoin PCR-reaktiossa onnistutaan monistamaan vain haluttua DNA-palasta, vaan sivutuotteena syntyy enemmän tai vähemmän epäspesifisiä monistustuotteita. Usein epäspesifisyydet jätetään kiireessä huomiotta, jos myös haluttua monistustuotetta löytyy hitunenkin lopputuloksena. Nämä epäspesifisyydet vähentävät kuitenkin merkittävästi oikean PCR-tuotteen saantoa, joten tavoite on pyrkiä niistä eroon ja maksimoida sekä oikean PCR-tuotteen määrä että puhtaus.
Yksi yleisesti tunnettu keino välttää epäspesifisyyttä on PCR-reaktioseoksen valmistaminen jäähauteessa, jolloin DNA-polymeraasin aktiivisuus pyritään pitämään mahdollisimman matalana. Tehokkaampi ja varmempi tapa välttää epäspesifisyyttä on kuitenkin hot start DNA-polymeraasin valinta. Hot start DNA-polymeraasi aktivoituu vasta yli 90°C:ssa eli DNA-kaksoisjuosteiden denaturoiduttua, mikä vähentää merkittävästi epäspesifistä alukkeiden tai juosteiden sitoutumista.
Markkinoilla on lukuisia hot start DNA-polymeraaseja niin perus PCR-reaktioihin kuin vaativimpiinkin applikaatioihin. Ahkerasti PCR-reaktiolevyjä käsittelevät robottiohjatut laboratoriot vaativat hot start DNA-polymeraasilta erityistä stabiiliutta, spesifisyydestä lainkaan tinkimättä. Bio-Radin iTaq™ – ja iProof™ DNA-polymeraasit ovat hot start DNA-polymeraaseja, joiden ainutlaatuinen vasta-aine-pohjainen hot start-teknologia mahdollistaa PCR-reaktion erityisen spesifisyyden.
Hankala DNA-näyte vaatii DNA-polymeraasilta erityisiä ominaisuuksia
DNA-polymeraasin prosessiivisuutta voivat hidastaa monenlaiset tekijät. Itse näytteessä voi olla monenlaisia DNA-polymeraasin toimintaa estäviä inhibiittoreita ja sen vuoksi DNA-näytteen puhtaus on puhuttanutkin tuotekehittäjiä viime vuosina erityisen paljon. Nykyään löytyy Direct PCR-kittejä, jotka mahdollistavat PCR-reaktion suoraan kasvi-, veri- tai eläinkudosnäytteistä, ilman DNA:n puhdistamistarvetta. Näiden kittien salaisuus piilee DNA-polymeraasiin liitetyssä pienessä DNA:han sitoutuvassa proteiinissa, joka auttaa sietämään epäpuhtauksia, lisäämään entsyymin nopeutta sekä parantamaan saantoa.
PCR-reaktiossa myös erilaiset lämpötilasyklit toistuvat ja se asettaa DNA-polymeraasille omat lämmönkestävyysvaatimuksensa. DNA-polymeraasin on pysyttävä stabiilina, oli lämpötila mikä tahansa ja mielellään vielä mahdollisimman pitkään. Erityisesti pitkiä ja lukuisia G/C-nukleotidipareja sekä sekundäärirakenteita sisältävät DNA-juosteet vaativat pitkiä denaturaatioaikoja korkeissa lämpötiloissa, johon perinteisten Taq DNA-polymeraasien sietokyky usein loppuu sekä prosessiivisuus kärsii. Mm. Promegalta löytyy GoTaq® Long PCR Master Mix ja New England Biolabsilta LongAmp® DNA-polymeraasituoteperhe, jotka kykenevät monistamaan jopa 30kb pituisen pätkän ihmisen genomista DNA:ta. Sama ominaisuus on myös monilla oikolukevilla DNA-polymeraaseilla.
Tehokkuutta optimoidulla ja/tai värillisellä reaktioseoksella
Valmiit reaktioseokset, jotka sisältävät kaikki PCR-reaktioon tarvittavat komponentit, lukuun ottamatta itse DNA-näytettä sekä alukkeita, ovat yleistyneet niiden helppokäyttöisyyden vuoksi. Master mixejä löytyy lähes kaikille DNA-polymeraaseille, niin rutiinikäyttöön kuin vaativimpiinkin applikaatioihin. Kun näytemäärät kasvavat ja samat reaktiot olosuhteineen toistuvat, eikä PCR-reaktioseoksen komponentteja tarvitse erikseen optimoida toimiviksi, master mix tuo tarvittavaa tehokkuutta PCR-työskentelyyn. PCR-reaktiossa on kuitenkin mm. MgCl2, jonka pitoisuutta voi joutua optimoimaan saavuttaakseen onnistuneen lopputuloksen. Optimaalinen Mg2+ -pitoisuus riippuu DNA-polymeraasista ja DNA:n pitoisuudesta. Liian suuri määrä estää denaturaation ja lisää alukkeiden epäspesifistä sitoutumista, kun taas liian pieni määrä vähentää saantoa. Näissä tapauksissa pelkkä DNA-polymeraasi ja puskuri voivat olla parempi valinta.
Viimeisimpänä lisänä niin DNA-polymeraasien kuin valmiiden reaktioseostenkin maailmaan ovat tulleet värit. Sen lisäksi, että vihreän, keltaisen, sinisen tai punaisen värin avulla on helpompi erottaa pipetoidessa tyhjien putkien pohjat tai levyjen kuopat ja vähentää pipetointivirheitä, niin ne mahdollistavat myös PCR-tuotteen pipetoinnin suoraan agaroosigeelille, ilman perinteistä värilatauspuskuria. PCR-tuotteen ajautumista agaroosigeelillä on helppo havainnoida värillisten viivojen avulla, ilman vaarallisten EtBr:n tai UV-valon tarvetta.
Ongelmia PCR-reaktion kanssa?
DNA-polymeraasien valmistajat ovat asiantuntijoita kaikenlaisten ongelmien ja valintojen kanssa, joita PCR-reaktioiden kanssa voi eteen tulla. Kokosin tähän loppuun muutamia linkkejä, joiden takaa löytyy kysymyksiä ja vastauksia yleisimpiin PCR-ongelmiin liittyen sekä apuja DNA-polymeraasin valintaan:
DNA Polymerase Selection Guides
New England Biolabs DNA Polymerase Selection Chart
Promega Taq DNA Polymerase Selection Guide
Thermo Scientific PCR Enzymes & Master Mixes
PCR Troubleshooting Guides
New England Biolabs PCR Troubleshooting Guide
Thermo Scientific PCR Troubleshooting Guide
Kirjoittanut: Sanna Partanen
