BioNordikan vieraskynäblogi

Transkriptomitutkimuksen työkaluna on laajasti käytössä RNA-sekvensointi. Sitä käytetään geeniekspressioanalyysiin: mutaatioiden havaitsemiseen, fuusiotranskriptien, vaihtoehtoisen silmukoinnin sekä transkription jälkeisten modifikaatioiden tutkimiseen. Toimittajamme New England Biolabs, Diagenode ja HTG Molecular tarjoavat erilaisia ratkaisuja tutkimuksesi avuksi.

RNA-Seq -kirjaston luominen

Standardimenetelmät RNA-kirjaston valmistukseen eivät säilytä tietoja DNA-juosteesta, josta RNA-juoste transkriptoitiin. Monesti tämä tieto on hyödyllinen, voidaan esim. tunnistaa antisense-transkriptit, määrittää transkriptoitu juoste ei-koodaavista RNA:sta ja koodaavien tai ei-koodaavien päällekkäisten transkriptien ekspressiotasot. Kaiken kaikkiaan kyky määrittää tieto alkuperäisestä juosteesta voi merkittävästi parantaa RNA-sekvensoinnin arvoa. Jo sopivaa kirjastokittiä valittaessa tulee päättää, haluaako lähteä tekemään directional tai non-directional kirjastoa. Lisäksi sekvensointiin käytettävä alusta vaikuttaa menetelmien yksityiskohtiin, yhteistä kaikille kuitenkin on:

• Ribosomaalisen RNA:n poistaminen: Suurin osa solussa olevista RNA-molekyyleistä on ribosomaalista RNA:ta (rRNA), ja koska se ei tämänhetkisen tiedon valossa ole tutkimuksen kannalta kiinnostavaa, se tulisi poistaa ennen RNA-kirjaston tekemistä. Vastaavasti globiini-RNA poistetaan yleensä verinäytteistä ja kloroplasti-RNA kasvien lehtinäytteistä. Kaksi yleisesti käytettyä vaihtoehtoa tälle vaiheelle ovat: rRNA depleetio (human/mouse/rat tai bakteeri) tai mRNA rikastaminen eukaryooteissa olevan Poly(A) hännän avulla. NEB:ltä on saatavissa myös RNA-depleetiokitti kustomoidulle depleetiolle, jolla voidaan esim. poistaa runsaasti esiintyvä sekvenssi tai depleetiotuotetta voidaan käyttää organismeille, jolle ei löydy valmista tuotetta.

• Fragmentointi: Sekvensointia varten sopivan kokoiset fragmentit muodostetaan fragmentoimalla RNA ennen käänteistranskriptiota ja cDNA-synteesiä, mieluummin kuin fragmentoimalla cDNA:ta. Fragmentointi voidaan tehdä toistettavasti ja ilman ristikontaminaation vaaraa sonikoimalla näyte Diagenoden Bioruptor -laiteperheen tarjoamilla laitteilla.

• Käänteistranskriptio ja toisen juosteen cDNA-synteesi: Komplementaarinen DNA (cDNA) muodostetaan RNA-templaatista käänteiskopioijaentsyymin (reverse transcriptase) Tämä ensimmäinen cDNA-juoste tehdään kaksijuosteiseksi käyttämällä DNA-polymeraasia.

• End repair, dA-tailing ja adapteerien ligaatio: kaksijuosteisen cDNA-kirjaston End-repair ja valinnaisen dA-tailing -vaiheiden jälkeen (tähän vaikuttaa käytettävä sekvensointialusta) tehdään tarvittavien adapterien ligaatio, jonka jälkeen kirjasto on valmis monistukseen sekä sekvensoitavaksi.

NEBNext.com-sivustolle on koottu tarkemmat tiedot tähän sovellukseen NEB:ltä saatavilla olevista tuotteista.

RNA-seq -lähtömateriaaleja koskevia suosituksia

Vaikka kirjaston valmistukseen on saatavilla erinomaiset kirjastokitit ja lisäksi protokollat on tehty mahdollisimman yksinkertaisiksi, myös lähtömateriaalin laatu vaikuttaa lopputulokseen.

Hyvälaatuisen RNA:n eristykseen on saatavilla kaupallisia eristyskittejä. NEB:n Monarch Total RNA Miniprep kitin avulla saadaan tehokkaasti eristettyä kaiken kokoiset RNA:t (>20 nt), kittiin kuuluu vakiona genomisen DNA:n poisto pylväässä. Vaihtoehtoisesti HTG Molecular tarjoaa RNA-sekvensointitekniikan, jossa EdgeSeq-laitteisto lähtee liikenteeseen eristämättömästä näytteestä ja rakentaa kirjaston tarjolla olevien paneeleiden avulla. Laajimmillaan voidaan tehdä koko transkriptomin laajuinen kirjasto (19 398 kohdetta).

RNA:n eheys:

• On tärkeää aloittaa hyvälaatuisesta RNA:sta, sillä hajonneen tai pilkkoutuneen RNA:n käyttö voi johtaa huonoon saantoon tai kirjaston muodostaminen voi kokonaan epäonnistua. Suosittelemme RNA-laadun määrittämistä RIN-arvon avulla (RNA integrity number). RNA-näytteen RIN-arvon tulee olla suurempi kuin 7.

• Eristetyn RNA:n eheys ja kokojakauma voidaan tarkistaa elektroforeesilla denaturoivalla agaroosigeelillä ja värjäämällä turvallisella nukleiinihappovärillä, kuten GelRed. Ribosomaalinen RNA tulisi näkyä terävinä raitoina värjätyssä geelissä. Eukaryoottisoluista eristetyllä ehjällä kokonais-RNA:lla raidat vastaavat 28S- ja 18S-alayksiköitä. 28S rRNA:n tulisi olla noin kaksi kertaa kirkkaampi kuin 18S rRNA:n. Tämä 2:1 suhde (28S:18S) viittaa ehjään RNA:han. Osittain hajonnut RNA-näyte ei näy geelillä selkeinä viivoina tai siitä ei voi osoittaa korkealaatuiselle RNA:lle ominaista 2:1 suhdetta. Täysin hajonnut RNA näyttäytyy epäselvänä, molekyylipainoltaan pienenä alueena.

• RNA-näytteessä ei saa olla mukana DNA:ta. On suositeltavaa tehdä DNaasi-digestio puhdistetulle RNA:lle.

RNA:n kvantifiointi:

• On tärkeää kvantitoida RNA-näytteen pitoisuus tarkasti ennen kirjaston rakentamista. Tämä voidaan tehdä fluoresenssimenetelmällä esimerkiksi käyttämällä Biotiumin RNA-spesifistä AccuBlue -kvantitointikittiä. Vaihtoehtoisesti RNA-pitoisuus voidaan määrittää mittaamalla absorbanssi 260 nm:ssä (A260) spektrofotometrillä, kuten NanoDrop®-laitteistolla. NanoDrop -laitteeseen sisäänrakennettu algoritmi osaa myös tunnistaa yleisimmät näytteessä olevat kontaminantit, ja jopa erottaa onko RNA -näytteen seassa dsDNA:ta.

Hyvälaatuinen näyte yhdessä laadukkaan RNA-kirjastokitin kanssa auttaa sinua rakentamaan kirjaston, jonka sekvensointi onnistuu ja saat luotettavia tuloksia tutkimukseesi. Katso tältä videolta tarkemmin, miten NEBNext Ultra II Directional RNA Library -kitti toimii ja ryhdy töihin!

Kirjoittanut Pia Ojala / BioNordika Oy