Luminesenssi- ja fluoresenssimääritykset

PerkinElmerin vieraskynä


Oletko ollut joskus tutkimuksesi tienhaarassa ja pohtinut, millä teknologialla jatkaa näytteidesi analysointia? Valitako luminesenssi, fluoresenssi intensiteetti vai ehkä aikaerotteinen fluoresenssi? Mitkä ovatkaan asioita, jotka on hyvä ottaa huomioon päätettäessä menetelmien viidakosta sitä parasta vaihtoehtoa omien kallisarvoisten näytteiden tulosten analysoimiseksi?

Useimmissa laboratorioissa tutkimuksia suunniteltaessa on tilanne, jossa mahdollisen teknologian tulee olla käytettävissä olemassa olevalla laitekannalla. Onnekkaat ovat ne, joilla vain taivas on rajana teknologiaa pohdittaessa; useimmiten realiteetit laiteinfrarahojen osalta asettavat varsin selkeät suuntaviivat mahdollisuuksien ympärille. Useimmilla on saavutettavissa fotometriaan perustuvat absorbanssimääritykset, monien ulottuvilla on myös luminesenssiin ja fluoresenssi intensiteettiin perustuvat menetelmät. Monileimalukijoiden yleistyttyä Wallacin aloitettua monileimalukijoiden maailmanvalloitus 25 vuotta sitten, tämän päivän laboratorioissa on aika hyvin käytettävissä myös aikaerotteisen fluoresenssin mahdollistavia lukijoita.

Kuvantamisreagensseja

Mitä eroja näillä tekniikoilla sitten oikein on? Jos laitekanta mahdollistaa minkä tahansa teknologian käytön, miksi sitten toinen valitsee luminesenssin, toinen taas fluoresenssi intensiteetin. Miksi joku on ehdoton, ja haluaa tehdä kaikkensa löytääkseen aikaerotteiseen fluoresenssiin pohjautuvan menetelmän omaan tutkimukseensa?

Jos teknologioita yrittää laittaa paremmuusjärjestykseen, uskon, että järjestyksiä on lähes niin monta kuin analysoijiakin. Jo pelkästään näytteiden ominaisuudet voivat aiheuttaa sen, että toisen näytteet eivät toimi yhdellä teknologialla, toisen eivät toisella. Jos miettii asiaa puhtaasti teknologian ja laitteissa tarvittavan raudan kannalta, uskallan väittää, että absorbanssi on teknologisesti yksi yksinkertaisimmista, mutta toisaalta myös heikoimmista menetelmistä. Fotometriaan perustuvia reagensseja on markkinoilla paljon, mutta teknologisesti absorbanssi ei ole kovin vahva teknologia; määritysten lineaarinen alue jää varsin kapeaksi ja tämä aiheuttaa väistämättä tilanteen, jossa tutkijan tulee tehdä useampia laimennoksia omista näytteistä päästäkseen määrityksen lineaariselle alueelle. Tämä voi olla haaste niin taloudellisesti kuin myös näytemateriaalimäärän osalta. Jos esimerkiksi hiiren seerumista halutaan analysoida useita eri biomarkkereita, ei näytettä yksinkertaisesti riitä kaikkiin määrityksiin.

In Vivo fluoresenssi-kuvannettu hiiri ja bioluminesenssi-kuvannettu hiiri

Fluoresenssi intensiteettiin perustuvia leimoja on runsaasti tarjolla markkinoilla. Joskus tuntuu, että uusia värejä syntyy kuin sieniä sateella, mutta olkoon se tutkijoiden ilo. PerkinElmerin uudet PhenoVue-värit kuuluvat tähän joukkoon. Cell painting-kitit muiden soluvärien joukossa ovat erittäin varteenotettavia vaihtoehtoja solutöiden parissa työskenteleville. PerkinElmerillä on myös runsaasti in vivo-töihin suunniteltuja värejä, joiden signaali tulee lähellä NIR-aluetta. Fluoresenssi intensiteetissä näytettä viritetään alemmalla aallonpituudella, ja emissiosignaalia analysoidaan lukijalla ylemmällä aallonpituudella. Verrattuna fotometriaan, määrityksen lineaarinen alue kasvaa, ja voi siinä mielessä antaa tärkeän edun fotometriaan perustuviin menetelmiin verrattaessa. Haasteena fluoresenssi intensiteetti -määrityksessä tosin voi olla epäspesifinen tausta esimerkiksi näytteessä olevien solujen aiheuttamana tai ehkä lukijalaitteen oikeiden filttereiden puuttumisen vuoksi. Filttereiden lisääminen laitteisiin ei tosin ole useinkaan hankalaa ja monissa laboratorioissa on myös käytettävissä monokromaattoriin pohjautuvia monileimalukijoita. Oman lisänsä fluoresenssi intensiteetin haasteisiin tuovat näytteet, jotka itsessään joko sammuttavat analysoitavaa signaalia, tai näytteen komponentit, jotka aiheuttavat ylimääräistä signaalia juuri leiman aallonpituusalueilla. Tällöin voi olla hyvä pohtia edelleen muita teknologioita.

PhenoVue Cell painting kit

Luminesenssiin perustuvia reagensseja on runsaasti markkinoilla. Myös PerkinElmerillä on koko joukko luminesenssiin pohjautuvia reagensseja; joukosta löytyy niin solu elävyyteen ja metaboliaan sekä sytotoksisuuteen  kuin reportterigeenimäärityksiinkin kuuluvia reagensseja, luminoivia solulinjoja ja bakteereita in vivo -töissä unohtamatta. Laitteen kannalta luminesenssi on yksinkertainen menetelmä; parhaimmillaan reagenssit ja näytteet sekoitetaan, inkuboidaan ja mitataan emittoituva valo, lineaarinen alue määrityksissä on hyvä ja näytteet eivät tyypillisesti aiheuta itsessään ylimääräistä signaalia mittauksessa. Mittauksen osalta on kuitenkin hyvä huomioida muutama tärkeä asia hyvän tuloksen saavuttamiseksi. Tyypillisesti luminesenssimäärityksiin suositellaan valkoisia levyjä. Eri levyvalmistajien valkoinen materiaali eksitoituu laboratorioissa käytetyistä kattolampuista eri tavoin, ja joskus hilpeyttä on herättänyt laskevan luminesenssisignaalin esittely täysin tyhjältä levyltä; levyn materiaali voi virittyä kattolampusta ja pimeään laitteeseen päästyä viritys vapautuu autofosforesenssinä, jota laitteella voidaan seurata. Laitteissa voi olla erilaisia menetelmiä kyseisen taustasignaalin detektion eliminoimiseksi, mutta pahimmillaan tämä voi peittää näytteiden pienet pitoisuudet allensa. Tärkeää olisi myös varmistaa, että itse mittalaitteen rauta ottaa huomioon viereisistä kaivoista tulevan vahvan signaalin crosstalkin. Koska luminesenssissa signaali saadaan ilman näytteen virittämistä, yksi aktiivinen kaivo voi peittää allensa vähintäänkin alhaisen signaalin viereiset kuopat. Tätä toki on kontrolloitavissa levyvalinnoilla, PerkinElmerilläkin on erittäin kattava määrä erilaisia mikrotiitterilevyjä erilaisiin tarpeisiin. Teemme paljon myös custom-koutattuja levyjä asiakkaillemme.  Laitevalmistajalla toki on myös oltava ymmärrys crosstalkin tärkeydestä ja asia on tärkeää ottaa huomioon myös tuloksia analysoitaessa. Joskus myös näytemateriaali voi aiheuttaa signaalin absorboitumisen niin, että näytteen signaali ei ikinä pääse laitteen detektorin analysoitavaksi.

Mitä uutta aikaerotteinen fluoresenssi sitten tuo teknologioiden viidakkoon? TRF-teknologian etu on se, että menetelmällä pyritään jo teknisesti poistamaan analyysistä signaali, jonka näytteen taustamateriaali voi aiheuttaa. Niin puskurit kuin levyn komponentitkin voivat aiheuttaa fluoresenssi intensiteetissä nähtävää taustaa, mutta aikaerotteisella mittauksella pyritään eliminoimaan tämän signaalin kerääminen; ainoastaan signaali, joka tulee leimatusta komponentista, tulee laitteilla määritetyksi. Niin herkkyydeltään kuin lineaariselta alueeltaan DELFIA teknologia on äärimmäisen mielenkiintoinen vaihtoehto, toisaalta heterogeenisyytensä johdosta joskus hankalaksi koettu. Näissä tilanteissa homogeeninen menetelmä (siis menetelmä, jossa ei ole pesuja, vaan parhaimmillaan näytteet ja reagenssit sekoitetaan, inkuboidaan ja mitataan) on tavoiteltu vaihtoehto. Niin LANCE kuin hTRF tekniikatkin edustavat aikaerotteisen fluoresenssin homogeenisia mittaustekniikoita. Vaikka näissä menetelmissä määrityksen lineaarinen alue ei ole samaa luokkaa DELFIAn kanssa, näytemäärän pienuus, menetelmän helppous ja vaivattomuus voivat olla tärkeitä argumentteja tutkimukselle, jossa on paljon näytteitä analysoitavana. Tässä kohdin suomalaiset fyysikot saavat nostaa kissanhäntäänsä! Heitä meidän on kiittäminen maailman parhaista TRF-lukijoista tässä universumissa. Olkaamme siis ylpeästi onnellisia suomalaisia😊!

Lisätietoa:

Luminesenssi:

https://www.perkinelmer.com/fi/category/cell-viability-proliferation-cytotoxicity-metabolism

https://www.perkinelmer.com/fi/category/in-vivo-imaging-reagents

Fluoresenssi intensiteetti:

https://www.perkinelmer.com/fi/category/cellular-imaging-reagents

https://www.perkinelmer.com/fi/category/in-vivo-imaging-reagents

Aikaerotteinen fluoresenssi:

https://www.perkinelmer.com/fi/category/immunoassays

https://www.cisbio.net/

Mikrotiitterilevyt:

https://www.perkinelmer.com/fi/lab-products-and-services/application-support-knowledgebase/microplates/microplates-knowledge-base.html

Kirjoittanut:
Jaana Hyvärinen – Account Manager – PerkinElmer Finland Oy, Finland
Riina Huovinen – Senior Reagents Sales Specialist – PerkinElmer Finland Oy, Nordics

Julkaistu: 23.5.2021