Kirjoittaja: Pedro Echave, Revvity

Syöpätutkimus on ottanut edistysaskeleita viime vuosina uuden sukupolven sekvensoinnin (NGS), ansiosta. Uniikit molekyylitunnisteet eli UMI:t ovat tärkeitä työkaluja NGS-sekvensoinnissa. Tässä blogikirjoituksessa syvennymme UMI-tunnisteisiin ja niiden käyttöön syöpägenomiikassa.

Mitä UMI:t ovat?

UMI:t, joita kutsutaan myös ”molekyyliviivakoodiksi” (molecular tai random barcodes), ovat lyhyitä nukleotidisekvenssejä, jotka liitetään NGS-kirjastoihin. Niitä käytetään merkitsemään jokainen näytteessä oleva molekyyli ainutlaatuisella sekvenssillä. Huomaa, että tämä eroaa perinteisistä uniikeista kaksoisindekseistä (UDI), jotka merkitsevät kunkin näytteen, mahdollistaen useiden näytteiden sekvensoinnin rinnakkain. Samasta näytteestä peräisin olevat kirjastot sisältävät saman UDI:n, mutta jokaisella yksittäisellä kirjastomolekyylillä on eri UMI (Kuva 1).

UMI-sekvenssejä käytetään näytteissä kahdesta syystä:

PCR-duplikaattien poisto: PCR-duplikaatit voivat vääristää myöhempiä analyysejä, erityisesti kun aloitetaan pienillä näytemäärillä tai työskennellään korkean GC-pitoisuuden alueiden kanssa. UMI:t mahdollistavat duplikaattien (joilla on sama UMI-sekvenssi) erottamisen todellisesta kopiomäärästä (jokaisella kopiolla on eri UMI-sekvenssi), mikä parantaa varianttien tunnistamisen tarkkuutta.

Virheiden korjaus: UMI:t poistavat ns. index crosstalkin aiheuttamia ongelmia ja sekvensointivirheitä, joita syntyy kirjaston valmistelun, monistamisen ja sekvensoinnin aikana. Merkitsemällä jokaisen alkuperäisen molekyylin ainutlaatuisella viivakoodilla, UMI:t auttavat meitä erottamaan todelliset variantit menetelmäartefakteista.

UMI-tunnisteiden hyödyt syöpätutkimuksessa 

1. Väärien positiivisten tulosten vähentäminen: kuten edellä mainittiin, UMI:t eliminoivat PCR-duplikaatit ja vähentävät menetelmäartefakteja. Täten kukin variantti lasketaan vain kerran, mikä vähentää vääriä positiivisia varianttituloksia. Tutkijat voivat luotettavasti tunnistaa somaattisia mutaatioita, kopiomäärävaihteluita ja muita genomisia muutoksia.
2. Harvinaisten varianttien havaitseminen: NGS-datalla on tyypillisesti alhaiset virheprosentit, mutta kun virheitä esiintyy, ne sekoitetaan usein todellisiin matalan esiintyvyyden variantteihin, jotka ovat tärkeitä syövän ymmärtämisessä. UMI:t parantavat kykyämme havaita erittäin alhaisen frekvenssin mutaatioita. Esimerkiksi on äskettäin osoitettu, että jopa 0,1 %:n alleelisella frekvenssillä olevia mutaatioita voidaan havaita UMI-merkityissä soluvapaan DNA:n (cfDNA) näytteissä ei-pienisoluista keuhkosyöpää sairastavilta potilailta.
3. Klonaalisen evoluution seuranta: Kasvaimet koostuvat geneettisesti monimuotoisista alaklooneista, jotka kehittyvät mutaatioiden, valintapaineiden ja mikroympäristön vuorovaikutusten ohjaamina. UMI:en avulla tutkijat voivat paikantaa mutaatioita, joita esiintyy pienessä osassa soluja. Analysoimalla geneettistä heterogeenisyyttä eri kasvainosissa saamme näkemyksiä kasvaimen etenemisestä ja hoitovasteista.
4. Robusti geeniekspression kvantifiointi: Laskennallinen PCR-duplikaattien poisto aiheuttaa vääristymiä ja tiedon menetystä. Yleinen käytäntö on poistaa kaikki paitsi yksi luentatulos: oletetaan että useammat luennat ovat kuitenkin peräisin samasta cDNA-molekyylistä. Tämä oletus ei kuitenkaan välttämättä päde. Kohdistus poistaa monia biologisesti merkityksellisiä luentatuloksia, etenkin runsaasti esiintyvien transkriptien kohdalla. UMI:en sisällyttäminen tarjoaa luotettavamman ja tarkemman tavan kvantifioida geeniekspressiotasoja. Tämä on ratkaisevan tärkeää syöpään liittyvien signaalireittien ymmärtämisessä ja mahdollisten terapeuttisten kohteiden tunnistamisessa.

Käytännön sovellukset

Potilaan hoito: UMI-tunnisteita käytetään yhä enemmän kliinisissä ympäristöissä yksilölliseen syöpähoitoon. Tarkka varianttien tunnistaminen auttaa tekemään hoitoa koskevia päätöksiä.

Lääkekehitys: Tutkijat käyttävät UMI-tunnisteita lääkeresistenttien varianttien tunnistamiseen ja kasvaimen evoluution tutkimiseen hoidon aikana.

Minimaalisen jäännöstaudin havaitseminen: UMI:t auttavat havaitsemaan jäljellä olevia syöpäsoluja hoidon jälkeen, mikä ohjaa jatkohoitoa.

Lopuksi

Unique Molecular Identifier-tunnisteet ovat merkittävästi muuttaneet syöpägenomiikkaa parantamalla tarkkuutta, herkkyyttä ja ymmärrystämme kasvaimen heterogeenisyydestä. UMI-tunnisteilla on todennäköisesti yhä merkittävämpi rooli syöpätutkimuksessa, mikä johtaa lopulta parempiin hoitotuloksiin potilaille maailmanlaajuisesti.

Revvity on kehittänyt täyspitkiä UDI-UMI-viivakoodeja, jotka on suunniteltu Illumina®- ja Element Biosciences AVITI™ -sekvensointialustoille. Näitä viivakoodeja voidaan käyttää DNA- ja RNA-sovelluksissa, ja ne ovat yhteensopivia Revvityn kirjastokittien tai minkä tahansa muun kitin kanssa, kunhan adapterit sidotaan T-A-ligaatiolla.