MikroRNA:t (miRNA:t) ovat keskimäärin 22 nukleotidin pituisia ei-koodaavia RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geenien ilmentymistä transkription jälkeen. Ne löydettiin vuonna 1993 – siitä lähtien miRNA:t ovat kiinnostaneet tutkijoita: ne säätelevät geenien ilmentymistä, ovat stabiileja ja niiden on osoitettu olevan osallisina monissa sairauksissa, kuten syövässä. Vuoden 2024 lääketieteen Nobel-palkinto myönnettiin Victor Ambrosille ja Gary Ruvkunille mikroRNA:iden löytämisestä.

Tässä blogissa tarkastelemme miRNA-molekyylien merkitystä biomarkkereina.

Synteesi ja toiminta

MiRNA:iden valmistuminen solussa on erittäin säännelty prosessi. Kanonisten miRNA:iden synteesi alkaa RNA-polymeraasi II -entsyymin transkriptoidessa primaarisia miRNA:ita (pri-miRNA:t) miRNA-geenistä. Nämä pri-miRNA:t käsitellään tumassa Microprocessor-kompleksin avulla (johon kuuluvat Drosha ja DGCR8) ja syntyy esiaste-miRNA:ita (pre-miRNA:t). Pre-miRNA:t kuljetetaan sitten solulimaan, jossa Dicer-entsyymi käsittelee ne edelleen kypsiksi miRNA:iksi. On olemassa kaksi muuta tunnettua reittiä miRNA:n synteesille, mutta niiden mekanismeja ei vielä ymmärretä hyvin.

Kypsät miRNA:t liitetään sitten RNA-indusoituun hiljentämiskompleksiin (RISC), joka ohjaa kompleksin kohdistumaan kohde-mRNA:iden 3′-UTR-alueelle emäspariperiaatteen perusteella.

MiRNA:n ilmentyminen on kullekin kudokselle omanlaistaan. MiRNA:n ilmentymisen häiriöt liittyvät läheisesti erilaisiin sairauksiin: syöpä, sydän- ja verisuonitaudit, hermoston rappeumasairaudet ja aineenvaihduntasairaudet. Tämän blogin kirjoitushetkellä on olemassa yli 30 000 vertaisarvioitua tutkimusta, jotka yhdistävät muuttuneita miRNA-tasoja sairauksiin.

Syövän yhteydessä miRNA:t voivat toimia kasvunrajoitegeeneinä tai onkogeeneinä kohdistumalla geeneihin, jotka osallistuvat kasvaimen kehittymiseen ja etenemiseen tai solunjakautumisen estämiseen. Eri kasvaintyypeille voidaan tunnistaa erilaisia miRNA-profiileja, joita voidaan hyödyntää syövän diagnoosissa, ennusteessa ja hoidossa. Esimerkiksi miR-17-92-klusteri estää esimerkiksi PTEN-, E2F- ja TGF-β-signalointireittiä. Se ajaa kasvaimen kasvua, ja sen on raportoitu olevan yliekspressoitu pienisoluisessa keuhkosyövässä, paksusuolisyövässä, maksasolusyövässä, kilpirauhassyövässä, kolorektaaliadenoomaorganoideissa ja munuaissyövässä. Toinen esimerkki miR-21 vähentää PTEN-, TPM1- ja PDCD4-ilmentymistä. Tämän miRNA:n yliekspressiota on raportoitu syöpäpotilaiden veriplasmassa ja kasvaimissa, ja se liittyy huonoon ennusteeseen rintasyövässä.

MiRNA-29-perhe ilmentyy runsaasti aivoissa, missä se liittyy solujen selviytymiseen. On havaittu, että miR-29:n ilmentyminen on alentunut Alzheimerin taudissa, ja se osallistuu BACE1:n säätelyyn, joka on amyloidi-betaa tuottava entsyymi ja amyloidiplakin keskeinen komponentti.

Neljäs esimerkki miR-155 osallistuu verenpaineen säätelyyn kohdistumalla angiotensiini II tyyppi 1 -reseptoriin. Tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-155:n ilmentyminen on lisääntynyt keuhkoverenpainetaudissa ja se on yhdistetty verenpaineen säätelyyn raskaushypertensiossa.  

MiRNA:t solunulkoisessa tilassa

Solunulkoisia miRNA-molekyylejä on kaikkialla kehossa. Niitä on havaittu kaikissa tähän mennessä testatuissa ihmisen kehon nesteissä, mukaan lukien plasma, sylki, virtsa, rintamaito, kyynelneste, aivo-selkäydinneste, keuhkopussin neste, vatsaonteloneste, lapsivesi ja siemenneste. Mielenkiintoista kyllä, useat miRNA:t esiintyvät ainoastaan tietyissä kehon nesteissä. Ne muodostavat 0,1-1% koko solunulkoisesta RNA:sta, paitsi plasmassa, jossa niiden osuus on jopa 5 %. Eri nestetyyppien välillä on suuria eroja havaittavissa olevien uniikkien miRNA-lajien määrässä. Sylki on yksi näytetyypeistä, jossa on suurin määrä havaittavia miRNA-lajeja (>400).

Kyky havaita miRNA:ita verenkierrossa mahdollistaa ei-invasiivisen näytteenoton, mikä on erityisen hyödyllistä varhaista sairauden havaitsemista ja taudin seurantaa ajatellen.

Toisin kuin muut RNA-lajit, miRNA:t ovat vakaita solunulkoisessa tilassa. Esimerkiksi veren säilytysputkien säilöntäaineilla on vain pieni vaikutus miRNA-profiileihin, ja tiedetään, että veren miRNA-sormenjälki on vakaa jopa säilytettäessä näytettä huoneenlämmössä 24 tunnin ajan. MiRNA:t ovat suojattuja hajoamiselta, koska ne muodostavat komplekseja erilaisten proteiinien, kuten Argonaute 2:n ja HDL-lipoproteiinien kanssa. Osa miRNA:sta on suljettuna solunulkoisiin kalvorakkuloihin eli vesikkeleihin (EV) (6-10% kehon nesteiden miRNA:sta). EV:t välittävät solujen välistä viestintää toimimalla ”ajoneuvoina”, jotka siirtävät lastinsa solusta toiseen. Ne ovat kätevä tutkimuskohde, koska niiden sisältö heijastaa usein emosolun biologista tilaa.

Tähän mennessä ihmiseltä on löydetty vain 2 654 erilaista kypsää miRNA:ta eli ne ovat paljon yksinkertaisempi tutkimuskohde kuin lähetti-RNA tai proteiinit. MiRNA:t ovat lisäksi ei-koodaavia, joten ne ovat vähemmän alttiita geneettisille mutaatioille verrattuna proteiineja koodaaviin geeneihin. Siksi ne ovat vakaita biomarkkereita.

Menetelmät verenkierrossa olevien miRNA:iden havaitsemiseen ja kvantifiointiin

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) on laajalti käytetty menetelmä miRNA:n havaitsemiseen. Se mahdollistaa miRNA-tasojen tarkan kvantifioinnin jopa pienissä näytetilavuuksissa, mikä tekee siitä ihanteellisen harvinaisten miRNA:iden havaitsemiseen solunulkoisissa nesteissä. qPCR on suhteellisen nopea ja kustannustehokas kun näytteitä ei ole suuria määriä. Sen suurin ongelma on kuitenkin rajallinen kyky ”multipleksaukseen”, mikä tarkoittaa, että sillä voidaan analysoida vain muutamia miRNA:ita kerrallaan. Lisäksi qPCR vaatii ennakkotietoa kohde-miRNA:n sekvensseistä, mikä voi olla rajoittava tekijä tutkittaessa uusia tai huonosti karakterisoituja miRNA:ita.

Mikrosiruteknologia puolestaan mahdollistaa tuhansien miRNA:iden samanaikaisen analysoinnin. Tämä tekee siitä tehokkaan työkalun uusien miRNA:iden löytämisessä ja miRNA:n ilmentymisen profiloinnissa. Mikrosiruilla on kuitenkin alhaisempi detektioherkkyys verrattuna qPCR:ään ja uuden sukupolven sekvensointiin (next generation sequencing, NGS), ja niihin voivat vaikuttaa ristihybridisoituminen ja taustakohina. Lisäksi mikrosirujen käyttö vaatii laajaa data-analyysiä ja validointia muiden menetelmien, kuten qPCR:n, avulla.

NGS tarjoaa kattavan ja puolueettoman lähestymistavan miRNA:n havaitsemiseen, ja sillä voidaan havaita sekä tunnettuja että uusia miRNA:ita. NGS pystyy analysoimaan koko miRNA-transkriptomin yhdellä ajolla, mikä tekee siitä ihanteellisen biomarkkereiden löytämiseen. Se mahdollistaa myös saman miRNA:n rinnakkaisten muotojen havaitsemisen yhden emäksen tarkkuudella. NGS on kuitenkin kalliimpaa ja aikaa vievempää verrattuna qPCR:ään ja mikrosiruihin. NGS:n tuottama data vaatii laajaa bioinformatiikka-analyysiä.

Lue lisää Revvityn ratkaisusta miRNA-sekvensointiin ja tartu vain City-Labin kautta voimassa olevaan, kaikkien reagenssien ja kulutustavaroiden -14 % tarjoukseemme, joka on voimassa 12.3.2025 asti.

Lähteet:

1. Hayes, J., Peruzzi, P. P., & Lawler, S. (2014). MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends in Molecular Medicine, 20(8), 460-469.
2. O’Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., & Peng, C. (2018). Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Frontiers in Endocrinology, 9, 402.
3. Wang, K., Yuan, Y., Cho, J. H., & McClarty, S. (2018). MicroRNAs in body fluids as biomarkers for non-invasive disease diagnosis. Advances in Clinical Chemistry, 85, 73-102.
4. Sheinerman, K. S., & Umansky, S. R. (2019). Circulating cell-free microRNA biomarkers for Alzheimer’s disease. PLoS One, 8(7), e69841.
5. Chakrabortty, A., Patton, D.J., Smith, B.F., Agarwal, P. (2023) miRNAs: Potential as Biomarkers and Therapeutic Targets for Cancer. Genes.14(7):1375
6. Li, S., Lei, Z. & Sun, T. The role of microRNAs in neurodegenerative diseases: a review. Cell Biol Toxicol 39, 53–83 (2023).
7. Ko, S.Y., Lee W., Naora, H. (2024), Harnessing microRNA-enriched extracellular vesicles for liquid biopsy. Front. Mol. Biosci. 11:1356780.
8. Bofill-De Ros, X., Vang Ørom, U.A. (2024) Recent progress in miRNA biogenesis and decay, RNA Biology, 21:1, 1-8
9. Searles, C.D. (2024). MicroRNAs and Cardiovascular Disease Risk. Curr Cardiol Rep 26, 51–60