Vasta-ainetuotannon perusteet: kuinka löytää ”kultainen omena”?

BioNordikan vieraskynäkirjoitus

Vasta-aineet eli immunoglobuliinit ovat paljon käytettyjä biologisia tutkimustyökaluja, jotka sitoutuvat voimakkaasti toisiin proteiineihin reseptoriensa avulla. Vasta-aineiden avulla voidaan mm. tunnistaa, kvantifioida ja eristää erilaisia biomolekyylejä, soluja tai kudoksia. Nykyään vasta-aineita valmistetaan useilla eri menetelmillä, mutta olipa kyseessä polyklonaalinen, monoklonaalinen tai rekombinantti vasta-aine, tuotannossa tärkeintä on löytää kultainen omena* eli tuote, joka tunnistaa kohdemolekyylin erittäin herkästi ja tarkasti.  Mutta miten tämän kultaisen omenan löytää?

Polyklonaaliset, monoklonaaliset ja rekombinantti vasta-aineet

Polyklonaaliset vasta-aineet on perinteisesti tuotettu immunisoimalla eläimiä antigeenillä (esim. peptidi tai proteiini). Eläimen elimistö tunnistaa vieraan biomolekyylin, jolloin sen B-solut alkavat tuottaa antigeeniä tunnistavia vasta-aineita. Eläimen verestä (seerumista) kerätään B-solut, joista eristetään ja puhdistetaan immunoglobuliinit. Eläimessä tuotettu polyklonaalinen vasta-aine on siis heterogeeninen seos eri immunoglobuliineja, jotka tunnistavat tietyn proteiinin, mutta vasta-aineet sitoutuvat useisiin antigeenin epitooppeihin.

Monoklonaalisen vasta-aineen tuotanto alkaa samalla tavalla kuin polyklonaalisen vasta-aineella, mutta immunisaation jälkeen eläimen pernasta eristetään yksittäiset B-solut, jotka fuusioidaan syöpäsolujen (myeloomasolujen) kanssa. Näitä kuolemattomia hybridoomasoluja voidaan kasvattaa solumaljoilla. Solut erittävät vasta-aineita kasvatusmediaan, josta vasta-aineet voidaan helposti eristää ja puhdistaa. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat siis yleisesti spesifimpiä kuin polyklonaaliset vasta-aineet, sillä jokainen hybridoomasolulinja (klooni) tuottaa vain yhteen kohdeproteiinin epitooppiin sitoutuvaa vasta-ainetta.  

Nykyään valmistetaan kasvavassa määrin rekombinantti vasta-aineita eli synteettisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Rekombinantti vasta-aineet tuotetaan in vitro solulinjoissa,jotka ovat transfektoitu vasta-ainegeeniä sisältävillä, geneettisesti muokatuilla vektoreilla. Rekombinantti-DNA -tekniikalla voidaan valikoiden tuottaa joko kokonaista vasta-ainemolekyyliä (raskas- ja kevytketjut) tai ainoastaan osia vasta-ainemolekyylistä.  Rekombinantti vasta-aineet tuotetaan usein nisäkässoluissa, mutta myös bakteeri-, hiiva- ja hyönteissoluja käytetään yleisesti. Rekombinantti vasta-aineiden etuja ovat mm. minimaaliset vaihtelut tuotantoerien välillä (eng. lot-to-lot consistency), eläinvapaa tuotanto, nopeampi tuotantoprosessi, kuin perinteisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla.

Kultaisen omenan metsästys!

Kun vasta-aineita tuottavat solut on saatu kasvamaan, alkaa parhaiden kloonien haravointi ja kultaisen omenan etsiminen käyttäen useita erilaisia vasta-ainemenetelmiä. ELISA on usein ensimmäinen menetelmä, kun tutkitaan eri kloonien sitoutumista kohdeproteiiniin. ELISA menetelmää käytetään myös yleensä immunisaation aikana, jotta nähdään, onko antigeeni aiheuttanut eläimessä immuunivasteen. Vain ne kloonit, joiden tuottamat vasta-aineet sitoutuvat ELISA-kuoppalevyn pohjaan kiinnitettyyn kohdeproteiiniin siirtyvät tuotannossa eteenpäin.

Western blot

Western blot on yksi eniten käytetyimpiä vasta-ainemenetelmiä biologisessa tutkimuksessa. Western blottaus on hyvä tapa tarkastella vasta-ainekloonien spesifisyyttä tunnistaa oikea kohdeproteiini sekä tutkia minkä eläimen kohdeproteiinia tutkittava vasta-aine pystyy tunnistamaan.

Western blot -kalvo

 Western blot-testeissä tulisi käyttää useita eri solulinjoja sekä biologisesti relevantteja näytteitä, jotka ilmentävät eri määriä kohdeproteiinia, jotta herkimmät ja spesifisimmät vasta-aineet saadaan selville. Myös negatiivinen kontrolli tulisi olla aina mukana testauksessa. Western blot-menetelmässä kohdeproteiini denaturoituu, jolloin kaikki sen epitoopit paljastuvat. Tämän vuoksi western blottausta ei suositella käytettävän ainoana validointimenetelmänä, sillä kohdeproteiinin laskostuessa jotkut epitoopit voivat olla vasta-aineelta ”piilossa”. Jos vasta-aineen tunnistama epitooppi on piilossa kohdeproteiinin laskostuneessa natiivimuodossa, eikä vasta-aine pääse sitoutumaan siihen, ei kyseinen vasta-aine näin ollen sovellu käytettäväksi esim. immunohistokemiassa (IHC) tai virtaussytometriassa. Tämä täytyy kuitenkin testata eri menetelmillä.

Aktivoituihin proteiineihin (esim. fosforyloidut proteiinit) spesifisesti sitoutuvat vasta-aineet eivät saisi sitoutua kohdeproteiinin inaktiiviseen muotoon ja tämän testaamiseen tulee käyttää käsiteltyjä kudos/solumalleja, joissa kohdeproteiinin aktivoitumista joko inhiboidaan tai aktivoidaan. Fosfataasi-käsittelyllä voidaan fosforyloiduista proteiineista kontrolloidusti poistaa fosfaasit, eikä fosfo-proteiinispesifinen vasta-aine näin ollen pysty sitoutumaan kohdeproteiiniin.

Immunohistokemia ja kuvantaminen

IHC on paljon käytetty menetelmiä mm. syöpätutkimuksessa ja diagnostiikassa. Immunohistokemiassa ohuista kudosleikkeistä värjätään vasta-aineiden avulla halutut kohdeproteiinit. Yleensä kudosleikkeet fiksataan formaliinilla, jolloin proteiinit ja muut molekyylit säilyvät luonnollisessa muodossaan ja mikroympäristössään. Myös vasta-aineiden IHC-testauksessa biologisesti pätevien näytteiden käyttö on tärkeää, sillä vain näin toimimalla saadaan vasta-aineen herkkyys parhaiten selville. IHC:ssa on suositeltavaa käyttää sellaisia kudosleikkeitä, joissa samassa värjäyksessä nähdään sekä kohdeproteiinia ilmentäviä että ei-ilmentäviä soluja.

Immunohistokemian värjäysprosessi

Mikäli solut eivät tuota vasta-aineen kohdeproteiinia tai jos endogeeninen ekspressio soluissa tai kudoksessa on hyvin pieni, täytyy testauksessa käyttää kohdeproteiinia tuottavaa DNA plasmidia, joka transfektoidaan tutkittavien solujen sisään. Kuvantaminen on paras tapa selvittää, että vasta-aineen tunnistama kohdeproteiinit ovat niiden oikeassa sijainnissa joko kudoksessa tai solussa. Jos esimerkiksi tumassa ilmentyvää proteiinia tunnistavan vasta-aineen huomataan sitoutuvan solukalvon proteiineihin, voidaan olettaa, että kyseinen vasta-aine ei ole spesifinen kyseiselle tumaproteiinille.  Kuvantamisella saatuja validointituloksia voidaan todentaa myös muilla menetelmillä, kuten in situ –hybridisaatiolla, jossa fluoresoivilla RNA-koettimilla tunnistetaan solut, joissa kohdeproteiinia tuotetaan.

Validointitulosten vertaaminen

Kun etsitään parasta vasta-ainekandidaattia, on myös tärkeää verrata saatuja testituloksia toisiin vasta-aineisiin ja muilla menetelmillä saatuun dataan. Jos markkinoilta löytyy vasta-aineita, joita on käytetty tieteellisissä julkaisuissa, voidaan vertaamalla selvittää antavatko testattavat vasta-ainekandidaatit samanlaisia tuloksia. Julkisesti saatavilla olevat tietokannat, kuten CCLE ja Human Protein Atlas, pitävät sisällään suuren määrän genomista informaatiota ja on tärkeä selvittää, että vasta-aineen validointitulokset korreloivat aiemmin julkaistun datan kanssa.

Kultainen omena

Kultaisen omenan, eli parhaan vasta-aineen, etsiminen ja löytäminen on työläs prosessi ja se vaatii paljon tietoa, taitoa ja aikaa sekä monien eri menetelmien hyödyntämistä. Mikään menetelmä ei yksinään pysty tarjoamaan tarvittavaa määrää tietoa vasta-aineen validaatioon. Vasta-ainetuotannossa tulee käyttää monipuolisesti erilaisia työkaluja sekä saatavilla olevaa informaatiota tutkittavasta kohdeproteiinista ja sen toiminnasta. Vasta-ainetoimittajilla onkin tärkeä vastuu omien tuotteiden toimivuudesta, jotta tutkijoilla olisi parhaat työkalut luotettavan ja hyödyllisen tutkimustyön tekemiseen.

* Tekstissä kultaisella omenalla viitataan BioNordikan vasta-ainetoimittajan, Cell Signaling Technologyn (CST), videoon, jonka voit halutessasi käydä katsomassa täältä: https://www.cellsignal.com/learn-and-support/videos-and-webinars/webinar-story-of-an-antibody-whiteboard

Kirjoittanut Juho Niva / BioNordika

Julkaistu 25.4.2021